*章離心機(jī)及轉(zhuǎn)子的分類：

一．離心機(jī)的分類：

上對離心機(jī)的分類方法有三種：按用途分、按轉(zhuǎn)速分和按結(jié)構(gòu)分。

按用途分類：分為制備型離心機(jī)和制備分析離心機(jī)。

制備型離心機(jī)：僅供分離濃縮，提純試樣的離心機(jī)。

制備分析離心機(jī)：不但能分離濃縮、提純試樣，而且可以通過光學(xué)系統(tǒng)對試樣的沉降過程進(jìn)行觀察、拍照、測量、數(shù)字輸出、打印自動顯示的離心機(jī)。

按轉(zhuǎn)速分類：分為低速離心機(jī)、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)。

低速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速在10000rpm以內(nèi)或相對離心力在15000×g以內(nèi)。

高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速在10000～30000rpm以內(nèi)或相對離心力在15000～70000×g以內(nèi)。

超速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速在30000rpm以上或相對離心力在70000×g以上。

按結(jié)構(gòu)分類：

一般在高速和低速離心機(jī)根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分類，品種繁多，各廠家命名也無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。可分為臺式離心機(jī)、多管微量臺式離心機(jī)、細(xì)胞涂片離心機(jī)、血液洗滌臺式離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、大容量低速冷凍離心機(jī)、低速冷凍離心機(jī)、臺式高速冷凍離心機(jī)、臺式低速自動平衡離心機(jī)等。另外國外還有三聯(lián)式（五聯(lián)式）高速冷凍離心機(jī)，專作連續(xù)離心用。

二．轉(zhuǎn)子的分類應(yīng)用及特點(diǎn)

轉(zhuǎn)子是離心機(jī)用于分離試樣的核心部件，轉(zhuǎn)子規(guī)格、品種的多少是衡量離心機(jī)生產(chǎn)技術(shù)掌握程度的重要標(biāo)志，轉(zhuǎn)子一般可分為下列五大類：

固定角轉(zhuǎn)子（Eixed-Angle-Rotor）：

主要用于分離沉降速度有明顯差異的顆粒樣品。顆粒在扇形溶地移動的距離很短，碰到外壁的顆粒沿著管壁滑到管底，形成沉淀，因此這樣轉(zhuǎn)子能很快地收集沉淀物。分離過程中，由于管壁的作用，在離心管內(nèi)將會引起強(qiáng)烈的對流，對具有相同沉降速率的顆粒會產(chǎn)生不良影響。

水平轉(zhuǎn)子（Siwing-Bucket-Rotor）：

主要用于樣品作密度梯度離心。顆粒移動距離長，溶液中的組分相對于管壁的位置在離心過程中和離心后不發(fā)生改變，因此離心效果好，但因顆粒在離心場中是從旋轉(zhuǎn)中沿徑向散離出去，而不是按相互平行的路線沉降。顆粒碰到外壁沿著管壁滑到管底，因此也會產(chǎn)生對流。（但比固定角轉(zhuǎn)子小）低速時(shí)啟動或停機(jī)時(shí)會產(chǎn)生振動，影響分離效果，水平轉(zhuǎn)子有敞開式和封閉式兩種，一般制備容量大，轉(zhuǎn)速小于10000RPM，離心力場在16000×g以內(nèi)的，作成敞開式，主要用于樣品的初分離。制備容量較前者小，轉(zhuǎn)速大于10000RPM，離心力場在16000×g以上的，為了減少風(fēng)力的影響，一般作成封閉式，主要用于線粒體、葉綠體、細(xì)胞核等的分離和密度梯度離心。

連續(xù)離心轉(zhuǎn)子（Continuous-Flow-Rotor）：

主要用于懸浮介質(zhì)中高速分離較小的顆粒物質(zhì)，如在培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，在運(yùn)轉(zhuǎn)過程中，懸浮樣品以一定速度從轉(zhuǎn)子體中心流入離心池，由于溶液中的組分輕重不同，在離心力場作用下，重粒子具有較大的慣性離心力、沉降快，當(dāng)流速增大（降低）到一定值時(shí)，重粒子將留在離心池外緣底部，而介質(zhì)將從出口流出并帶走較輕的粒子，收集組分的方法是把組分沖洗出離心池或者留在轉(zhuǎn)子體內(nèi)，這種轉(zhuǎn)子是利用離心淘析技術(shù)隊(duì)整細(xì)胞或大的亞細(xì)胞粒子進(jìn)行分離，在無菌和低溫條件下，被分離的組分,能保持活性，回收率高等優(yōu)點(diǎn)。如果液流方向與離心力方向相反，即降低了粒子運(yùn)行速度，相當(dāng)于增長了運(yùn)行距離，從而提高了分辨能力。

區(qū)帶轉(zhuǎn)子（Zonal-Rotor）：

主要用于大容量的密度梯度離心，當(dāng)實(shí)驗(yàn)所需制備的樣品量多，而水平轉(zhuǎn)子因受到量的限制時(shí)，采用區(qū)帶離心是較好的。主要由帶有四塊葉片的轉(zhuǎn)子體和密封系統(tǒng)組成，轉(zhuǎn)子體和四塊葉片將離心池分為四個扇形小室，阻止溶液在離心池中旋轉(zhuǎn)，葉片上有徑向?qū)Ч埽芤和ㄟ^導(dǎo)管從中心流向轉(zhuǎn)子體外壁，裝樣和取樣時(shí)應(yīng)小心，裝樣一般在2500~3000rpm運(yùn)轉(zhuǎn)中進(jìn)行，首先將梯度液中較輕的部分通過密封管道泵入轉(zhuǎn)子內(nèi)，由于慣性力的存在，梯度液在轉(zhuǎn)子外壁的垂直方向形成均勻的一層，再依次將密度較高的梯度液泵入，隨著密度的增高和梯度液的不斷泵入，密度較低的梯度液被推向中心，直到轉(zhuǎn)子*裝滿，然后通過密封組件中心輸液管把待分離的樣品（其密度與梯度液中zui輕的密度部分還低）加入，接著把密度更低的溶液注入，用以取代中心附近的樣品，裝完后，移去密封組件，蓋上轉(zhuǎn)子蓋，在一定轉(zhuǎn)速離心一定時(shí)間后，轉(zhuǎn)速降至2500~3000rpm，裝上密封組件及輸液管，通過泵入較密的液體到轉(zhuǎn)子的液體由輕至重依次擠出。

區(qū)帶轉(zhuǎn)子避免了用離心管所引起的壁效應(yīng)（Walleffects）和干擾，提高了分辨率。

主要用于樣品在短時(shí)間作密度梯度離心。水平轉(zhuǎn)子分離粒子位移距離長，分辨能力高，分離后組分的區(qū)帶較寬，便于回收，但所需時(shí)間長，垂直轉(zhuǎn)子分離的粒子位移距離等于離心管直徑。轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動前，管內(nèi)密度梯度溶液的密度是沿重力方向變化，轉(zhuǎn)動后，溶液的密度逐漸改變?yōu)殡x心力方向（水平方向）變化，離心結(jié)束后，溶液的密度變化方向因重力作用又沿鉛垂方向變化，形成鉛垂方向的密度梯度，由于離心管是垂直放置，所以溶液粒子位移的距離等于離心管的直徑。離心時(shí)間短，離心后樣品組分的區(qū)帶較寬，但因離心時(shí)間短，粒子得不到充分分離，將會失去一些組分，又因區(qū)帶與梯度介質(zhì)的接觸面大，易于擴(kuò)散，停機(jī)后密度重新定向，易于混合，所以作區(qū)帶離心的效果，垂直轉(zhuǎn)子不于水平轉(zhuǎn)子。

離心機(jī)轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速跟轉(zhuǎn)子的材料和強(qiáng)度有關(guān)，一般采用強(qiáng)度好、重量輕的超硬鋁合金（LC4），超速離心機(jī)采用鈦合金（TiC4）。一般來說，對同一離心機(jī)重量輕、容量小的轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速要高，反之轉(zhuǎn)速要低。轉(zhuǎn)子的保養(yǎng)及壽命管理在以后的章節(jié)中介紹。

第二章基本概念

一、關(guān)于相對離心力（relative centrifugal force，RCF）

當(dāng)裝有樣品溶液的離心管、瓶、或袋的轉(zhuǎn)子置于與馬達(dá)相接的轉(zhuǎn)軸上時(shí)，通過馬達(dá)提供的動力會使轉(zhuǎn)子快速旋轉(zhuǎn)，離心技術(shù)正是利用這種高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力達(dá)到使樣品溶液中不同性質(zhì)的顆粒得以相互分開的目的，離心力的大小與旋轉(zhuǎn)速度以及旋轉(zhuǎn)半徑成正相關(guān)性。由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻(xiàn)中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。

RCF就是實(shí)際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。

F離=M×ω2×r

M：運(yùn)動物體的質(zhì)量

ω：運(yùn)動物體的角速度

r：運(yùn)動物體的質(zhì)量半徑

然而，圓周運(yùn)動的物體，除受離心力作用外，還受到重力的影響。因此，通常用相對離心力（RCF）來比較不同型號的轉(zhuǎn)子以及轉(zhuǎn)子在不同速度旋轉(zhuǎn)時(shí)離心力的大小，公式換算如下：

RCF=F離/F重=Mω2r/Mg=ω2r/g

由于：ω=2πn/60

n：轉(zhuǎn)速（rpm）

r：旋轉(zhuǎn)中心至轉(zhuǎn)頭內(nèi)離心管某一部位的半徑（cm）

g：為地球重力加速度（980cm/sec2）

所以：RCF=1.118×10-5×n2×r

為了計(jì)算轉(zhuǎn)子的zui大離心力，必須知道離心機(jī)使轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)的zui高速度（nMax）以及轉(zhuǎn)子的zui大半徑（rMax），即離心管底至主軸間zui大距離。

例如：6Ds4.2轉(zhuǎn)子所允許的zui大轉(zhuǎn)速為4200rpm，其zui大離心半徑為25.4cm，因此該轉(zhuǎn)子的zui大相對離心力為：

RCFMAX=1.118×10-5×25.4×42002=5018×g

如果這一轉(zhuǎn)子以2000rpm離心時(shí)，它的相對離心力為：

RCF=1.118×10-5×25.4×20002=1138×g

由于RCF值隨著轉(zhuǎn)速的平方而增大，因此轉(zhuǎn)速的變化會引起RCF更大的變化。

在上式的基礎(chǔ)上，Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對應(yīng)的離心力的轉(zhuǎn)換列線圖，見下圖，在用圖1將離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)換成相對離心力時(shí)，先在離心機(jī)半徑標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)半徑和在轉(zhuǎn)數(shù)標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)簡劃一條直線，在圖中RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)，即為相應(yīng)的離心力數(shù)值。例已知離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機(jī)的半徑為7.7cm，將兩點(diǎn)連接起來交于RCF標(biāo)尺，此交點(diǎn)500×g即是RCF值。

為了使某一特定轉(zhuǎn)子的離心條件能在另一個類型的轉(zhuǎn)子上重復(fù)并獲得同樣的分離效果，應(yīng)該考慮到下述相對離心力與離心時(shí)間（t）長短間的關(guān)系：

t1×RCF1=t2×RCF2

例1：Js5.2轉(zhuǎn)子的zui大半徑為22.6cm，當(dāng)該轉(zhuǎn)子以4000RPM運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，可以算出離心管底部的RCF=4050g，離心10分鐘能得到滿意的結(jié)果，如果換用Js4.2轉(zhuǎn)子（Rmax=254mm）仍用4000RPM轉(zhuǎn)速，它的RCF為4550g，也許500g的差異會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為了獲得同樣的離心效果，可根據(jù)：

t1=t2×RCF2/RCF1=10×4050/4550=8.9分

因此，Js4.2轉(zhuǎn)子4000RCF離心8.9分鐘的離心效果與JS5.2（rMAX=226mm）來重復(fù)上述條件則可算出所需的運(yùn)行轉(zhuǎn)速（n）。

n=1000√3430/1.12×226=3681r/min

也就是說JS5.2的離心速度為3681rpm時(shí)，產(chǎn)生的RCF是3430g。

二、離心技術(shù)常用的數(shù)學(xué)計(jì)算

W/w％、w/v％的換算及蔗糖母液的稀釋：

用重量/重量百分?jǐn)?shù)（w/w％）表示的濃度，在數(shù)值上與用重量/體積百分?jǐn)?shù)（w/v％）表示的濃度相差極大，例如65％（w/w％）的蔗糖溶液在0℃時(shí)相當(dāng)于86％（w/v％）。而對氯化銫（CsCl），這二者的差別就更大，如53％（w/w％）的CsCl相當(dāng)于87％（w/v％）。

例：設(shè)有密度為1.638g/ml重量百分比濃度為32％（w/w）的氯化銫求其重量/體積百分?jǐn)?shù)（w/v％）

由公式Cw/v=Cw/ρ可知

Cw/v=32/100×1.638=53％

為方便一般可先配制較濃的母液如66％（w/w）的蔗糖溶液66％（w/w）

蔗糖溶液=2.55M=53％（w/v）折光指數(shù)=1.4558密度=1.3224g/ml在稀釋時(shí)根據(jù)下面公式換算

V稀釋后的體積×C稀釋后濃度

V母液=C母液后濃度（w/v）  

例：現(xiàn)有66％（w/v）的蔗糖溶液（p=1.3224），當(dāng)配100m120％ （w/w） （p=1.081）的蔗糖溶液時(shí)需要母液量如下：

V母液=100×1.081×20％/1.3224×66％=24.8ml

因此，取母液24.8ml，加水至100ml即成20％（w/w）的蔗糖溶液。

B.總離心效果ω2T及ω2T積分值的應(yīng)用

離心過程中往往包括啟動、加速、恒速、減速及運(yùn)轉(zhuǎn)終止等階級，在離心機(jī)轉(zhuǎn)子從靜止開始被加速過程中，加在樣品上的相對離心力也逐漸增大，在減速時(shí)，情況恰恰相反，一些較大的轉(zhuǎn)子，其加、減速過程延誤時(shí)間較長，對于較粗略的實(shí)驗(yàn)，往往簡單地以恒速階段的離心效果ω2T來表示，如進(jìn)行較精密的分析實(shí)驗(yàn)，應(yīng)將這段時(shí)間內(nèi)樣品粒子的移動納入考慮的范圍，除了恒速階段的離心效果外，還要加上加、減速過程的離心效果，因此引入了總離心效果--TCE（total centrifugal effect）并用∫ω2d t來表示，即ω2T的積分值。

∫ω2d t總離心效果用于計(jì)算粒子的沉降子數(shù)（S）。

S=1nr2 /rl /∫ω2d t=1nr2 /r 1/ TCE

r1：離心前粒子與軸心距離

r2：離心后粒子與軸心距離

目前Backman公司等一些生產(chǎn)廠家配有自動的ω2T積分器，當(dāng)設(shè)置轉(zhuǎn)速和運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間后。全自動算出ω2T的積分值或設(shè)置ω2T值只需設(shè)一恒定的速度，離心機(jī)會自動確定所需的離心時(shí)間。

在設(shè)有ω2T自動積分器的情況下，可以利用ω2T圖來計(jì)算總的離心效果，并可得到滿意的結(jié)果，Backman公司給出了SW50.1等十種轉(zhuǎn)子的ω2T圖。這些圖中雖只標(biāo)出了二種密度曲線，對于其它密度可根據(jù)該二種密度曲線來估計(jì)所需的時(shí)間，也可以計(jì)算粒子的沉降系數(shù)。

例：計(jì)算離心時(shí)間

根據(jù)所希望的粒子的沉降位置從圖中找出相應(yīng)的Sω2T值

已知條件：實(shí)驗(yàn)用轉(zhuǎn)子：SW50.1離心用介質(zhì)：5-20％蔗糖密度：1.8g/ml，溫度：20℃，轉(zhuǎn)速：40000rpm，粒子沉降系數(shù)：30S=3x10Q。求：粒子在90mm處形成離心帶需離心時(shí)間。

解：從SW50.1轉(zhuǎn)子的Sω2T曲線圖上可以查得總離心效果Sω2T=0.54

據(jù)ω2T=Sω2T/S=0.54/30=1.8

根據(jù)角速度ω和轉(zhuǎn)速度RPM之間的換算公式ω=0.10472RPM

因此：ω2=（0.10472RPM）2=1.75×10所以：T=ω2T/ω2=1.8×10/1.75×10=10286秒

C.氯化銫（CsCl）沉降平衡曲線的應(yīng)用

在實(shí)際工作中,往往從文獻(xiàn)中查得分離某一物質(zhì)的運(yùn)行參數(shù)（溫度、速度、起始密度等），但是，如果查不到這些參數(shù)，那么，究竟在什么條件下進(jìn)行等密度離心，才能使離心結(jié)果滿意呢？

在等密度離心中，常用氯化銫作梯度物質(zhì)，所以Backman公司的每個轉(zhuǎn)子說明書中都附有該轉(zhuǎn)子的CsCl沉降及平衡曲線，利用這些曲線，就可得到zui合適的運(yùn)行參數(shù)。

三、離心分離的幾種方法

制備型超高速離心機(jī)的幾種分離方法：

A.差速離心：逐次增加離心力，每次可沉降樣品溶液中的一些組份。

差速離心是一種zui常用的方法。在這種方法中，離心管在開始時(shí)裝滿了均一的樣品溶液。通過在一定速度下一定時(shí)間的離心后，就可得到兩個部分：沉淀和上清液。

通常在*次離心時(shí)把大部分不需要的大粒子沉降去掉。這時(shí)所需的組份大部分仍留在上清液中。然后將收集到得上清液可以進(jìn)行一步的離心，把所需的粒子沉積下來。離心的時(shí)間要選擇得當(dāng)，使大部分不需要的更小的粒子仍留在上清液中。對于得到的沉淀和上清液可以進(jìn)行一步的離心，直到達(dá)到所需要的分離純度為止。

1、差速離心的特點(diǎn)是操作簡單，但分離純度不高。

B.密度梯度離心法：可以同時(shí)使樣品中幾個或全部組份分離，具有很好的分辨率。

1）速率區(qū)帶法（rate zonal）：

根據(jù)樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度（S）。大致步驟如下：

在離心管中裝入密度梯度溶液，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加（正梯度）。

將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負(fù)梯度。

由于不同大小的粒子在離心力作用下，在梯度中移動的速度不一樣，所以經(jīng)過離心后會形成幾條分開的樣品區(qū)帶。

注意：樣品粒子的密度必須大于梯度液注中任一點(diǎn)的密度。離心過程必須在區(qū)帶到達(dá)管子底部前停止。

2）等密度離心法（isopycnic）：

根據(jù)粒子的不同密度來分離。離心過程中，粒子會移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶。密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度液粒上面或均勻分布在密度必須梯度中。經(jīng)離心后，樣品粒子達(dá)到它們的平衡點(diǎn)。注意：平衡后粒子的分離*由其密度決定，與時(shí)間無關(guān)，此時(shí)再改變離心轉(zhuǎn)速，只能改變區(qū)帶的相對位置。

2、密度梯度分析法

1）、梯度介質(zhì)性質(zhì)與選擇：

A.應(yīng)具備的性質(zhì)：

梯度物質(zhì)的選擇原則是滿足分離方法的基本要求，一個理想的密度材料標(biāo)準(zhǔn)它應(yīng)是：

l 所形成的溶液密度應(yīng)包括所需要的密度范圍。

l 具有某些性質(zhì)，如折射率，據(jù)此可測定它的濃度。

l 所形成的溶液粘度低。

l 不損傷所分離的樣品。

l 離心分離后容易除去。

l 不妨礙離積分的分析。

B.常用介質(zhì)種類：

表一、常用梯度材料在20℃密度

C.梯度介質(zhì)應(yīng)用范圍：

表二、等密度梯度介質(zhì)的應(yīng)用

+++很好 ++好 +可以 --不適用

表三、各種大分子在蔗糖梯度液中的大約密度

2）、梯度溶液的準(zhǔn)備：

計(jì)算

稀釋（本文第三章*部分）

3）、梯度形狀

梯度形狀分：線型、等速型、階梯型、平坦型、陡峭型指數(shù)梯度。（如下圖）

梯度形狀對于分離是否成功非常重要：

zui常用的是線型梯度，適用于分離蛋白質(zhì)、酶、激素、核糖體亞基和一些植物病毒；等速型適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品；不連續(xù)或階梯型梯度zui適用于分離整細(xì)胞、亞細(xì)胞組分以及純化一些哺乳類動物病毒或昆蟲病毒。等速梯度以及長液柱可增進(jìn)分離能力，適D.梯度柱制備：

梯度液柱可以用手工或梯度儀制備。

半注法：

為縮減離心時(shí)間，或分離樣品較少可用半注法：下半管鋪置梯度介質(zhì)，中間加樣品，上面鋪Buffer或液體石蠟油。

4）、加樣方法與加樣量：

將樣品加到梯度液柱上，針尖和離心管成45-60°角度，慢慢地將樣品沿管壁流到液面上去，對于DNA一類易斷的脆弱樣品，應(yīng)該用孔徑較大的移液管代替針頭，以避免剪切力對樣品的切割作用。樣品濃度是梯度柱zui小密度的1/10（W/W）。

5）、轉(zhuǎn)子的選擇與效應(yīng)：

6）、分離區(qū)帶的回收及檢測

離心后所形成的區(qū)帶樣品的回收方法基本有四種：

a.穿刺法：

穿刺離心管底部，使梯度溶液滴出，將一具有適合閥門的蓋帽放在離心管頂，可控制滴出速度。

b.虹吸法：

將一毛細(xì)管輕輕插入管底，盡量防止梯度抖動，用微量泵逐漸滴取，以一定量滴數(shù)或體積部分收取。

c.加壓法：

通過一針管將高密度的液體泵入到梯度離心管的底部，部分收集換出的溶液。

d.切割法

采用的切割刀切割所需區(qū)帶。

區(qū)帶檢測：

所謂區(qū)帶檢測，實(shí)際上是對水平轉(zhuǎn)子或角轉(zhuǎn)子和垂直轉(zhuǎn)子離心管中的分離物質(zhì)所做的監(jiān)測，通常只是測量在260或280mm時(shí)長的吸收值，以決定梯度中的核酸或蛋白的整個分布，這個操作通常稱之為在線（on line）監(jiān)測。